WB常见问题解答（周四、05-19）
细胞之邦，互助你我。昨天我们给大家呈现了部分信号通路图，如大家有更多需求，可访问arigo、CST、genetex的官网，里面有更多信号通路的详细介绍。今天，我们给大家带来的是研究信号通路，常规实验WB，其常见问题分析。
1. 没有足够的一抗或二抗结合目标蛋白
适当的提高抗体的稀释比例，或者延长4度孵育时间
2. 抗原量不足或者蛋白样品降解
适当的提高上样量，或者尽量使用新鲜的样本组织。并且加入蛋白酶抑制剂
3. 转膜不充分
使用可逆染色剂例如丽春红S检测转膜效果,检查转膜操作是否正确。PVDF膜需预先浸在甲醇中，然后浸到转移缓冲液中。
4. 过度封闭使目标蛋白不能显色
代替5% 脱脂奶粉，使用含0.5% 脱脂奶粉或无脱脂奶粉的抗体稀释液，或更换封闭剂，减少封闭时间。
5.一抗不识别检测物种的蛋白
参照说明书，比对免疫原序列和蛋白序列以确保抗体和目的蛋白会发生反应，设置阳性对照。
6. 组织中目的蛋白含量低
浓缩使信号最大化（例如检测核蛋白要用核裂解物）。
7. 洗膜过度
勿过度洗膜
8. 二抗受叠氮钠抑制
避免叠氮钠和HRP标记抗体一起使用。如果一抗中含有叠氮钠，一抗完后洗膜充分
9. 检测试剂盒过期和底物失活
使用新鲜的底物。
1. 未进行非特异性封闭或封闭不充分：延长封闭时间，考虑更换合适的封闭剂
2. 一抗浓度过高：稀释抗体至合适浓度，以更高稀释度抗体孵育更长时间（耗时长但特异性结合最好）。
3.抗体孵育温度过高：4°C孵育。
4.一抗或二抗与封闭剂有交叉反应：在孵育和洗涤液中加入温和去污剂如吐温-20。脱脂奶粉含有酪蛋白，该蛋白本身就是一种磷酸化蛋白，会结合磷酸化特异性抗体而易产生高背景。使用BSA代替奶粉作为封闭剂
5. 未结合蛋白质洗涤不充分：增加洗涤次数
6. 膜的选择导致的高背景：NC膜比PVDF膜背景低
7. 膜干燥：在孵育过程中防止膜变干，在任何步骤都保证膜有充分的反应液，放入搅拌子不断搅动或轻轻振荡使膜浸在溶液中，避免出现干膜现象。
1. 体内表达的蛋白样本具有多种修饰形式如乙酰化、甲基化、烷基化、磷酸化、糖基化等：查阅文献，使用试剂使样品去磷酸化、去糖基化来验证翻译后的修饰。
2. 蛋白样本降解（蛋白质分子量降低）：在样品缓冲液中加入足够的蛋白酶抑制剂
3. 检测到未经报道过的新蛋白或同一蛋白家族中具有相似表位而结构不同的蛋白：查阅其它文献报道，或BLAST搜寻，使用说明书推荐的细胞株或组织。
4. 一抗浓度过高，高浓度时常出现多条蛋白带：降低抗体浓度和/或孵育时间。
5. 二抗浓度过高，高浓度产生非特异性结合：降低抗体浓度，增加二抗对照（不加一抗）
6. 条带为非特异性条带：应用封闭多肽来区分特异性和非特异性条带，只有特异性条带能被封闭从而消失。
7. 靶蛋白形成多聚体：SDS-PAGE电泳上样前，煮沸10分钟而不是5分钟，使蛋白质解聚。
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